產品簡介
腺相關病毒（AAV）是目前廣泛用于基因治療的病毒載體，其中AAV2是研究最為廣泛的血清型。當使用AAV2作為基因治療的病毒載體時，確定純化的AAV2顆粒滴度是一個重要的表征環節，也是臨床應用的一個關鍵步驟。
金斯瑞AAV2滴度衣殼蛋白ELISA試劑盒可用于病毒載體生產過程中定量測量AAV2樣本中總衣殼蛋白濃度。該ELISA試劑盒使得AAV2滴度測定更簡單、準確和可重復。
產品特點
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超寬線性范圍
產品檢測線性范圍為4.8×107 to 2.5×109 Capsids/mL。
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自帶AAV2質控品
ELISA試劑盒產品自帶AAV2質控品，無需單獨購買。
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高檢測精密度
產品批內差≤ 10%，批間差 ≤ 15%，保證滴度測定精密度。
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靈活配置
8孔x12條，提供96次檢測，可拆卸板條，靈活取用，隨取隨用。
檢測原理
金斯瑞AAV2滴度衣殼蛋白ELISA試劑盒利用了兩種抗AAV2衣殼蛋白的單克隆抗體，它們可與衣殼蛋白的不同表位結合。
當標準品或樣品加入捕獲板時，AAV2衣殼蛋白可以被包被在捕獲板上的抗衣殼蛋白捕獲抗體捕獲。然后在體系中加入與生物素結合的抗衣殼蛋白檢測抗體，該檢測抗體可以與捕獲板上結合的衣殼蛋白相互作用。隨后添加的鏈霉親和素-辣根過氧化物酶偶聯物 (Streptavidin-HRP) 可與生物素偶聯的抗衣殼蛋白抗體 (Biotin Anti-AAV2 Antibody) 相互作用。在洗滌步驟后，加入 3,3‘,5,5’-四甲基聯苯胺溶液（TMB溶液），可在體系中形成藍色復合物。通過添加終止溶液終止反應。終止溶液可使的體系顏色從藍色變為黃色。顏色強度可以通過酶標儀在 450 nm 和 650 nm 處讀取。測試樣品中衣殼蛋白的濃度可根據衣殼蛋白標準曲線實現精確定量。
Figure 1: AAV2滴度衣殼蛋白ELISA試劑盒檢測原理
驗證數據
回收率用于確定分析物檢測是否受樣品基質差異的影響，通過將已知量的分析物加標到不同的樣品基質中來驗證回收率。以下是根據具有代表性的準確度驗證生成的報告和數據示例，在這項驗證中，使用3批次試劑盒（Cat. No. L00942, GenScript），將已知量的分析物加標到基質中混合驗證回收率，樣本重復測量3次。根據性能評估結果，回收率應在80%-120%，則認為樣品基質對準確定量分析物的能力影響最小。
Table 1: 三批次試劑盒回收率測試結果
| 批次 | 重復次數 | 平均測值 Capsids/mL | 回收率 | |
|---|---|---|---|---|
| 實測 | 標準: 80%-120% | |||
| #1 | 3 | 1.99E+09 | 93% | 符合 |
| #2 | 3 | 2.05E+09 | 117% | 符合 |
| #3 | 3 | 1.86E+09 | 95% | 符合 |
A. 批內精密度/重復性
批內精密度驗證體現測定板內每孔之間的重復性，有助于確保在測定板的不同孔中運行樣本檢測可以給出可靠的結果。 以下是根據具有代表性的批內精密度驗證生成的報告和數據示例，在這項驗證中，使用試劑盒（Cat. No. L00942, GenScript）分別對低、中、高3個濃度水平的樣本進行測試，每個樣本各重復檢測10次，每個樣本計算10次測量濃度結果的平均值（M）和標準差（SD），計算變異系數(CV)。根據性能評估結果，所測結果 %CV應低于10%，表明該測定具有良好的重復性。
Table 2: 三批次試劑盒批內精密度驗證結果
| 批次編號 | 重復次數 | 平均測值Capsids/mL | %CV | |
|---|---|---|---|---|
| 實測 | 標準：≤10% | |||
| #1 | 10 | 1.37E+08 | 5% | 符合 |
| #1 | 10 | 4.71E+08 | 3% | 符合 |
| #1 | 10 | 1.87E+09 | 4% | 符合 |
| #2 | 10 | 1.65E+08 | 3% | 符合 |
| #2 | 10 | 5.15E+08 | 2% | 符合 |
| #2 | 10 | 1.99E+09 | 3% | 符合 |
| #3 | 10 | 1.41E+08 | 5% | 符合 |
| #3 | 10 | 4.64E+08 | 4% | 符合 |
| #3 | 10 | 1.79E+09 | 5% | 符合 |
B. 批間精密度
批間精密度體現同一樣品在多批測定間的重現性，有助于確保在不同批次試劑盒中運行樣本檢測可以給出可靠的結果。 以下是根據具有代表性的批間精密度驗證生成的報告和數據示例，在這項驗證中，使用3個不同批次試劑盒（Cat. No. L00942, GenScript）分別對低、中、高3個濃度水平的樣本進行測試，每個樣本各重復檢測10次，每個樣本計算30次測量濃度結果的平均值（M）和標準差（SD），計算變異系數(CV)。根據性能評估結果，所測結果 %CV應低于15%，表明該測定具有良好的批間精密度。
Table 3: 三批次試劑盒批間差驗證結果
| 批次數量 | 重復次數 | 平均測值Capsids/mL | %CV | |
|---|---|---|---|---|
| 實測 | 標準：≤15% | |||
| 3 | 3×10 | 1.47E+08 | 9% | 符合 |
| 3 | 3×10 | 4.83E+08 | 5% | 符合 |
| 3 | 3×10 | 1.88E+09 | 6% | 符合 |
根據AAV2滴度衣殼蛋白ELISA試劑盒產品手冊中的操作指南進行相關AAV滴度測定。將血清型1、2、5、6、8、9和DJ的AAV空載衣殼蛋白作為樣品，以各自不同的濃度添加到ELISA試劑盒微孔板中。檢測得到的OD值如下。
| 血清型 | 衣殼蛋白濃度 | 吸光度 (450/650 nm) | ||
|---|---|---|---|---|
| (Capsids/mL) | 重復 1 | 重復 2 | 平均值 | |
| AAV 1 | 1.07E+10 | 0.0124 | 0.0118 | 0.0121 |
| AAV 2 | 1.20E+10 | 4.975 | 5.0119 | 4.99345 |
| AAV 5 | 4.29E+10 | 0.0149 | 0.0128 | 0.01385 |
| AAV 6 | 3.13E+10 | 0.0169 | 0.0153 | 0.0161 |
| AAV 8 | 2.31E+10 | 0.0162 | 0.013 | 0.0146 |
| AAV 9 | 1.22E+10 | 0.0138 | 0.014 | 0.0139 |
| AAV DJ | 1.48E+10 | 0.0138 | 0.0131 | 0.01345 |
| 空白對照（僅緩沖液） | 0 | 0.0134 | 0.0114 | 0.0124 |
AAV2衣殼蛋白樣本的OD值高于空白對照的OD值，而所有其他測試血清型的AAV衣殼蛋白樣本的OD值都在背景范圍內。AAV2滴定衣殼蛋白ELISA試劑盒為AAV2滴定進行了特定校準，不能應用于其他血清型的AAV的滴定測定。
